利福平的抗菌谱广，对结核杆菌有良好的抗菌作用，与其他抗结核药合用有协同作用。对细胞内、外和代谢旺盛或近乎静止的结核菌均有杀菌作用，所以可以用于各种类型结核。在体内分布广，易于渗入各种组织和细胞内，在结核空洞、痰、肝、肾组织中浓度较高。能通过血脑屏障，可以治疗结核性脑膜炎。

但单独使用容易耐药，常与异烟肼或乙胺丁醇联用。利福平除了抗结核菌以外，对脑膜炎球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮链球菌、肺炎军团菌等也有一定的抗菌能力。利福平还做成眼药水，用于眼科治疗沙眼和结膜炎。利福平对麻风杆菌也有一定疗效。