使用青霉素主要是依据不同细菌感染的不同疾病进行选择。人体被致病菌感染，最常见的是球菌类，如葡萄球菌感染的脓肿、化脓性皮肤病、肺炎、败血症等；链球菌感染的丹毒、扁桃体炎、中耳炎、猩红热等。还有其他细菌及微生物感染的流脑、白喉淋病、炭疽、破伤风梅毒等。以上这些疾病一般均应选用普通青霉素，就是常用的青霉素钠。某些细菌尤其是金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌易耐药，所感染的皮肤、软组织及内脏的一些疾病，应选用新青Ⅱ号，即苯唑西林，或用氯唑西林。以上主要是革兰氏阳性菌感染的疾病。

对革兰氏阴性细菌类如脑膜炎球菌、流感杆菌、百日咳杆菌、痢疾杆菌、布氏杆菌等所致的泌尿系统、呼吸系统、胆道、肠道疾病等，以及脑膜炎、心内膜炎等应选用氨苄西林，或用口服的阿莫西林。

绿脓杆菌常可引起严重感染，还可与其他化脓菌造成混合感染，普通青霉素对这类感染无效。绿脓杆菌为假单胞菌属，选用抗假单胞菌青霉素，如羧苄西林，磺苄西林或哌拉西林等。